近日，我校生命科学学院、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士和陈乐天教授团队在国际著名学术期刊Molecular Plant（IF2020=13.164，生物学一区）在线发表了题为“STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences”的研究论文（论文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018）。该研究开发了一种适用于所有生物基因组的高效、特异地扩增超大片段DNA和体外大片段DNA合成的PCR新方法：抑制热交错PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）。
该PCR方法结合了两方面的原理。一是在正/反向特异引物的5’端引入一段相同的短序列（Tm = 68–72℃），使扩增片段的DNA链末端形成反向互补序列。在使用较低的引物浓度下，长度较短的非特异产物链（包括引物二聚体）的两末端容易相互配对形成茎环结构而阻止引物的结合，使PCR扩增受到强烈的抑制（PCR Suppression, PS）；而较大片段DNA链的两末端之间距离远，难以相互配对而PS效应较小，因此可以消除或减少非特异产物的竞争性扩增而强化目的大片段的特异性扩增。二是在链延伸阶段使用不同幅度（60–72℃）变温的嵌套热交错内循环（nested thermo-interlaced cycling, TIC），以优化具有不同GC含量分布的目标DNA序列的链延伸效率，最终提高扩增效率。这两种因素的结合可以产生明显的对长片段DNA扩增效率和特异性的倍加效应。另外，该研究还开发了一个在线工具calGC（http://skl.scau.edu.cn/calGC/, or http://www.ygliulab.club/calGC/），用于分析目标DNA序列的GC分布特征，并以此自动推荐一个合适的PCR热循环程序。
STI PCR工作原理图（A-C）及其在超长DNA片段扩增中的应用（D-I）
为了比较不同PCR方法对DNA长片段扩增的性能，该研究使用标准引物和抑制PCR引物，并结合常规热循环或嵌套热交错内循环条件进行了四组PCR扩增。结果只有STI PCR可以从水稻、玉米和人类细胞系等基因组中高特异性地扩增出从10 kb以上甚至30 kb以上（最高达38 kb）的各种长度的目标DNA片段。表明抑制PCR和嵌套热交错内循环这2个原理的结合产生了很强的扩增能力和特异性的叠加效应。
目前，体外DNA合成的主流方法是，以化学合成覆盖目标序列的重叠的寡核苷酸引物，再通过Polymerase Cycling Assembly（PCA）或overlapping PCR法将寡核苷酸引物进行目标DNA模板拼接、再进行常规PCR扩增。但这种方法一次体外合成DNA片段的长度通常限制在约3 kb以内。该研究利用modified PCA（mPCA）和STI PCR高效扩增目标序列，一次体外从头正确的合成达7 kb的重组基因序列。而且，该研究还利用mPCA-STI PCR将4个DNA片段（7.0 kb, 4.3 kb, 7.8 kb和5.3 kb）成功地组装为24.4 kb的连续片段。这些测试表明了STI PCR对大幅提升DNA合成和多片段组装能力的重要作用。
综上，该研究开发的STI PCR突破了当前PCR方法在扩增DNA片段大小和特异性方面的局限性，极大地提高了超大片段DNA扩增和DNA从头合成及多片段组装的能力，可广泛应用于基因克隆、功能分析、测序和基因组结构变异检测等研究，是一种重要的技术进步。而且，该calGC网站工具也有助于研究人员在日常的分子生物学研究中分析DNA序列的GC含量和分布特征，这些技术将极大地推动分子生物学、合成生物学和生物技术的发展。
博士后赵哲、团队青年教师谢先荣和刘伟智为该论文的共同第一作者，刘耀光院士和陈乐天教授为共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金重大项目、国家自然科学基金创新研究群体项目、广州市科技计划重点项目、广东省基础与应用基础研究重大项目和博士后科学基金面上项目的资助。（文图/生命科学学院）